2022年1月20日，耶鲁大学医学院干细胞中心遗传学系Bilal Cakir教授领导的研究团队在《nature communication》上发表了一篇研究报告，报告表明研究人员开发了一种从人类胚胎干细胞 (hESCs) 诱导生成人类皮质类器官 (hCOs) ，进而产生功能性小胶质细胞（即含小胶质细胞的 hCOs ，mhCOs）的方法。在功能上，mhCOs 中的小胶质细胞可以保护神经元免受 Aβ 沉积引起的细胞和分子损伤；在科研上，这个方法可用于基础研究和转化研究，开发研究小胶质细胞在神经发育和神经退行性疾病中作用的体外模型。
小胶质细胞是中枢神经系统 (CNS) 中的常驻巨噬细胞。它们的主要功能是在大脑中进行免疫监视，并通过调节神经元存活、突触形成、凋亡细胞消除和程序性细胞死亡来促进大脑网络的形成。研究表明，小胶质细胞功能受损与神经发育（即自闭症或精神分裂症）和神经退行性疾病（即阿尔茨海默病，AD）之间存在密切联系。因此，研究这些疾病下小胶质细胞的功能，必须开发对应的研究模型，模拟人脑中小胶质细胞的功能。
3D大脑类器官技术提供了一个研究人类大脑如何发展和经历神经系统疾病的可行性方案。通过小分子诱导或基于多功能干细胞 (PSC) 的内在神经外胚层分化可生成脑类器官。然而，大多数神经外胚层分化产生的脑类器官不包含中胚层细胞，例如小胶质细胞或内皮细胞。小胶质细胞只能从 hESC 分化或从原代组织中分离出来，与脑类器官共培养以研究其功能。总体而言，以高度可重复的方式在脑类器官中产生小胶质细胞，对于了解这些细胞在人脑中的功能以及剖析它们在疾病状态中的作用具有重要意义。
之前的研究表明，一种被称为 Pu.1的 ETS转录因子对于将细胞发育成骨髓细胞（包括小胶质细胞）至关重要， Pu.1 的过表达可将各种细胞类型重新编程为骨髓细胞。研究人员检查了hCOs中 PU.1 诱导的细胞是否可以分化为功能性小胶质细胞。共测试了两种方案：胚状体（EB）分化和神经元分化（如图1a，b）。在这两种情况下，5 天的 PU.1 诱导明显增加了小胶质细胞标志物（如IBA1）和 SALL1抗体的表达。但调节小胶质细胞存活，分化和增殖的集落刺激因子1（如Csf1r，Cd115）以及其他小胶质细胞标志物（如Tmem119，P2ry12）的表达没有增加（如图1c）。小胶质细胞标志物的有限诱导很可能是由PU.1 的短暂引入和下调相关体外环境造成的。IBA1的免疫染色结果（IF）进一步揭示了在EB或神经元分化的条件下过表达PU.1 5天的分化细胞中含有小胶质细胞（如图1d）。总体而言，这些数据表明，在神经外胚层分化条件下，PU.1 过表达会诱导 hESC 分化为骨髓细胞。
研究人员进一步测试了发育中的皮质类器官中 PU.1 的过表达是否可以诱导生成小胶质细胞。由于小胶质细胞占成熟脑细胞的 5-15%，研究员将 10% 的 PU.1 感染的 BC4 hESC 与 90% 的亲本 hESC 混合以产生 hCOs（图 1a）。hCOs 的 3D 实时成像揭示了 GFP+ 细胞在 30 天的 hCOs 处具有变形虫细胞形状的组织（如图 1e）。与 30 天龄的 hCOs 相比，70 天龄的 hCOs 包含更多数量的变形虫细胞形状的细胞（如图 1e）。与共聚焦成像一致，PU.1 诱导的 hCOs 在第70天表现出较多的小胶质细胞标志物表达（如图 1b）。此外，PU.1 诱导的 hCOs 显示小胶质细胞标志物 Iba1、Csf1r、Cd11b、Cx3cr1、Tmem119 和 P2ry12 的表达增加（如1b）。这些结果表明PU.1 过表达的 hCOs 含有小胶质细胞,研究人员将这些类器官命名为含有 hCOs (mhCOs) 的小胶质细胞。
图片来源于《Expression of the transcription factor PU.1 induces the generation of microglia-like cells in human cortical organoids》
为了研究在 mhCOs 中由 PU.1 诱导的小胶质细胞是否与体内小胶质细胞具有相似的功能，研究人员评估了30、70或90天大的mhCOs 中的小胶质细胞特征。研究发现在第70天，22%的小胶质细胞同时表达IBA1和MKI67，表明存在增殖的小胶质细胞（如图1g）；共免疫染色结果揭示了 IBA1+ 小胶质细胞内存在 PSD95，表明功能性小胶质细胞存在吞噬或接触 mhCOs 中神经元的突触结构（如图1h）；基于用单分子 RNA 荧光原位杂交检测神经元活性标志物Fos和Npas4，研究人员在第 70 天没有观察到 mhCOs和hCOs的神经元活性有任何差异；研究人员进一步证实，在第70-80天和第110-120天，hCOs和 mhCOs都含有功能性神经元。
接下来研究人员在小鼠大脑中检查了PU.1诱导的小胶质细胞在体内功能是否正常。研究人员将PU.1诱导的小胶质细胞移植到有免疫缺陷的小鼠大脑中并进行Aβ-oligo处理。移植3周后，人类特异性CD68和Aβ的免疫染色显示，PU.1衍生的小胶质细胞表现出复杂的分枝形态并且具有功能活性，会对寡聚Aβ产生反应。这些数据表明，PU.1 诱导的小胶质细胞在小鼠大脑环境中和人脑类器官中的功能相似。
作为大脑常驻骨髓细胞，小胶质细胞在大脑的稳态中发挥着关键作用。小胶质细胞的失调是人类大多数脑部疾病的潜在机制，包括 AD、ASD 和精神分裂症。然而，开发体外模型来研究小胶质细胞是一项重大挑战，原发性小胶质细胞或IPSC衍生的小胶质细胞是目前可行的方案。但研究表明，如果不考虑与大脑中其他细胞的相互作用，研究人员就无法研究小胶质细胞的功能和相关表型。研究小胶质细胞中的分子结构和细胞反应需要在大脑结构的背景下产生小胶质细胞研究模型。因此，研究人员开发出的mhCOs给了解人类小胶质细胞在健康和疾病状态下的功能提供了机会。
此次提出的mhCOs提供了一个方案，该方案可在脑类器官内生成可调节数量的诱导小胶质细胞，并通过单独的小胶质细胞或hCOs中的所有细胞的基因修饰来研究体外小胶质细胞的特异性功能。研究人员可以利用这一优势，结合CRISPRi来确定小胶质细胞中与 AD 相关基因在响应Aβ中的作用。与之前的研究相比，mhCOs不需要使用细胞因子和生长因子来诱导小胶质细胞，且mhCOs携带小胶质细胞可与人脑中小胶质细胞的位置和行为相对应。
虽然mhCOs提供了一个独特的方案，通过该方案和基因编辑可以研究与小胶质细胞相关的神经退行性疾病，但仍然存在局限性。一是小胶质细胞的分布在每个mhCOs内均不同。其次，并非所有在mhCOs 中过表达PU.1的细胞都分化为小胶质细胞簇，这表明存在转化效率低下或环境影响细胞分化的问题。最后，mhCOs不具备内源性血管系统，因此在发育后期会产生不健康的细胞。内部炎症的发生和细胞类型复杂性的缺乏可能导致小胶质细胞过早被激活以及过早的发育成熟。尽管如此，mhCOs开辟了新的途径来探索小胶质细胞在人脑类器官中对各种人脑疾病和大脑发育的功能。
宁波易赛腾生物科技有限公司 李福云编译
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