A. ECT-LV-TFs: 100 mL
B. ECT-Coating Solution (ECT-CS): 10 ml,5X
C. ECT-Golden Solution (ECT-GS): 0.25 ml, 1000X
D. ECT-NIM Supplement (ECT-NIMS): 10 ml,25X
E. ECT-Neural Induction Medium (ECT-NIM): 250 ml
操作步骤
1、提前准备待转化的皮肤成纤维细胞:按ScienCell公司推荐的方法培养,或在含有15% FBS及1X 青链双抗的高糖DMEM培养液中培养,一般需要5-7天可以长满汇合,每株细胞约需要2-3皿10cm培养皿。
1、解冻包被液(ECT-CS):在4℃过夜解冻或室温水浴快速解冻使用,避免多次反复冻融。
2、包被培养皿:把10 ml ECT-CS用DMEM稀释到50 ml,移取5 ml/皿,共10皿,置于37℃细胞培养箱中孵育过夜,用前吸去包被液即可,不需要洗涤,但应避免包被表面挥干。
1、皮肤成纤维细胞消化、计数与培养:吸去培养液,DPBS洗涤,胰酶37℃消化4分钟,加培养液中和胰酶并吹打成单细胞悬液,计数后在每个包被培养皿中加入8×10^5个细胞,摇匀后转入5% CO2细胞培养箱。
2、慢病毒解冻:在室温水浴中快速解冻后,酒精喷洗冻存瓶、擦拭后转入生物安全柜中操作。
3、慢病毒感染:皮肤成纤维细胞完全贴壁(一般约3-6小时)后,吸去培养液,立即小心加入慢病毒(7-10 ml/10 cm培养皿),转入37℃细胞培养箱(5% CO2)继续培养过夜。
1、成纤维细胞培养液换液:慢病毒感染18小时后,把含有残余病毒的培养液吸入含有84消毒液的废液瓶中,然后尽快加入10 ml/皿新鲜的成纤维细胞培养液,转入37℃细胞培养箱(5% CO2)继续培养过夜。
1、转分化培养液配制:把0.25 ml ECT-S7及10 ml ECT-NIMS加入250 ml 室温平衡的ECT-NIM中,混匀后即可使用,余下置于4℃避光保存。
2、快速转分化:在感染后第2天,吸去皮肤成纤维细胞培养液,加入10 ml/皿转分化培养液ECT-NIM,之后每2天行半换液。感染细胞表达GFP,转化5天后在荧光显微镜下可观察到胞体变小、隆圆饱满、突起生长等形态变化,至第10-12天基本转分化为神经细胞,此时可进行分离纯化、继续培养、鉴定分析及应用。